А не найдется ли у вас табака? Deadman

Сидела я как-то

работала
читала новости в Штерне. Случано кликнула на баннер (да-да, случайно), не успела даже посмотреть, что за баннер. И привел он меня на официальный вебсайт фирмы
Bayer. Уже собиралась было закрыть окно браузера, как смотрю, ба! знакомые все лица. Расценила я это как знак и решила, что пришло время об этом написать. Так что сегодня мы заглянем на кухню растительной
.

Точнее, на последний писк в научно-прикладном использовании растений, как биофабрик. До сих пор наиболее продуктивным считается синтез нужных веществ в бактериях. Это тоже генно-модифицированные микроорганизмы, которые уже давно и успешно продуцируют в специальных биореакторах витамины, ароматы, антибиотики, биологически-активные вещества для пищевой, косметической, фармацевтической промышленности. В этой технологии есть как преимущества, так и недостатки. Так что вопрос производства достаточного количества фармацевтических препаратов в живых организмах остается открытым. Над этой задачей работают многие ученые, а сегодя я хочу рассказать об одной
фирме, которая успешно работает в этом направлении.

Итак, идея простая и интересная. Берут специальную бактерию, которая называется
Agrobacterium tumefaciens и вставляют туда кольцевую молекулу ДНК (вектор), котрый содержит в себе последовательность, кодирующую некий белок, который нам надо затем получить в больших количествах. Затем разможают эту бактерию, разводят в жидкой среде и заполняют ванну. Затем в эту ванну вверх

ногами
корнями опускают растение табака так, чтобы оно было полностью погружено в эту жидкость, закрывают герметично и устраивают ему вакуум. Бактерия в таких условиях просто присасывается к растительной поверхности. Через некоторое время растение достают и несут "отдохнуть" в теплицу дней на десять. Бактерии тем временем устраивают с растительными клетками на поверхности листьев тесный контакт и передают им молекулу (вектор) с генетическим материалом. Вектор попадает в растительное ядро, где есть все инструменты, чтобы насинтезировать с него РНК, которая транспортируется в цитозоль. А там уже все готово, чтобы насинтезировать с РНК нужный нам белок.


Такого рода трансформация растений называется транзиентной, то есть временной. ДНК не встраивается в геном растения, а со временем разрушается. Но пока она есть и белок производится, можно срезать листья табака и выделить необходимый белок. Картинка слева наглядно показывает очаги продукции белка в ультрафиолете. В данном случае белок, который синтезирует растение, называется GFP (green fluorescent protein) и способен светиться в ультрафиолете.

Пару слов про фирму Icon Genetics, которая с некоторых пор стала дочерней фирмой Bayer (по-нашему, Байер ее купил). Филиал фирмы находится в г. Халле (Германия), основатель и научный директор фирмы академик НАН Украины
Юрий Юрьевич Глеба.

Немного о клонировании.

Прошлая неделя ознаменовалась сразу двумя прорывами в технологии клонирования животных.

Немного вводной терминологии и истории.

Итак, клонирование- от греческого κλων, не что иное, как точное воспроизведение объекта некое количество раз. Проклонировать можно как отдельный биологический организм, так и отдельную клетку, или даже отдельную молекулу. В
клонировании растений или бактерий ничего сложного нет, поскольку бактериям характерно размножение в результате простого деления, а растениям свойственно вегетативное размножение. На
молекулярном клонировании генов я вообще останавливатся не буду.
Клонирование животных и человека значительно более сложный процесс и стал возможен благодаря целому ряду предшествующих открытий и технологий. Об этом клонировании

Пару слов о технологии клонирования.

Для клонирования животных всегда необходимо наличие так называемой
плюрипотентной клетки. Как известно, все клетки организма имеют один и тот же генетический набор. Но в каждой клетке не работает весь геном одновременно, а только лишь та его часть, которая необходима для обслуживания какого-то типа клеток: в нервных клетках "запущена" генетическая программа нервных клеток, в мышечных работает "мышечная" программа и так далее. Прелесть плюрипотентной клетки в том, что в ней можно запустить любую из программ: от программы эмбрионального развития до программы дифференцирования в какой либо отдельный тип клеток, которые уже будут называться дифференцированными и
унипотентными. Здесь надо остановиться и научиться

различать терапевтическое клонирование от репродуктивного.


Репродуктивное клонирование – это процесс производства отдельного организма, генетически идентичного тому, из которого клонируют. Чаще всего используют метод пересадки ядер соматических клеток. Для этого берут или уже оплодотворенную яйцеклетку (Ну что значит берут? Если это мышка, то мышку убивают. А если это что побольше, то достают под общим наркозом), или еще чаще оплодотворяют ее
in vitro, есть мнение, что можно брать даже неоплодотворенную яйцеклетку (специалисты меня поправят), затем выделяют из нее ядро и заменяют его ядром из любого другого организма, который мы собираемся клонировать. На выходе получаем клетку с чужим ядром, которая в принципе имеет все, для того, чтобы совершить следующее деление (запустить эмбриональную программу) и превратиться в эмбрион, который потом имплантируют в самочку и ждут клонированного потомства. Строго говоря, полученное потомство весьма условно считается подобным тому, из которого взяли ядро. Напомню, что генетические материал содержится не только в ядре, но и в митохондриях, которые никто не заменял, поэтому они остались материнскими. Таким образом наклонировали уже целую кучу животных (все помним овечку Долии из лаборатории Ian Wilmut), но до обезьян пока не добрались. До сих пор единственная клонированная макака получена методом дробления эмбриона и это немного не то, что нам надо.

Терапевтическое клонирование подразумевает не производство целого организма, а только выращивание определенных тканей или даже органов. Технология на начальных стадиях не особенно отличается от репродуктивного клонирования. Только в даном случае задача не запустить эмбриональную программу, а после нескольких делений эмбриональной клетки разрушить эмбрион и выделить стволовые клетки. Эмбриональные стволовые клетки в иерархии "Что бы из них теперь сделать" стоят выше всех. Они называются
тотипотентными, это порядком круче, чем
плюрипотентрые. То есть из них можно сделать все. Кроме эмбриональных стволовых существуют еще "взрослые" стволовые, которые есть в костном мозгу, коже, в жировых тканях, печени, селезенке. Эти стволовые клетки уже не тотипотентые, а плюрипотентные и способны развиваться только в ограниченное число разных клеток. Для терапевтического клонирования это очень полезные клетки, хотя и не всемогущие. Проблема заключается в том, что их непросто достать. Поэтому поиски подходящего источника плюрипотентных клеток, а также способов их диференцирования во что-то полезное не прекращаются.

Наконец мы подошли к прорывам прошлой недели.

В 2003 ученый Gerald Schatten сказал: "With current approaches, NT [nuclear transfer, a cloning technique] to produce embryonic stem cells in nonhuman primates may prove difficult — and reproductive cloning unachievable". Это он сказал после того, как ему не удалось получить ни единственного клона из 716 яйцеклеток обезьян.

Уже в 2004 году корейский ученый Woo Suk Hwang заявил, что ему удалось получить человеческие эмбриональные стволовые клетки. Однако два года спустя оказалось, что его результаты сфальсифицированы и это отложило прогресс в клонировании на неопределенное время. А точнее до ноября 2007 года.

Именно тогда появилась статья Шухрата Милитапова из Орегонского университета о успешном получении линии эмбриональных стволовых клеток из обезьяны. После неудачи корейского ученого, Милитапов решил уйти в сторону от репродуктвного клонирования и постараться получить линию стволовых клеток в пробирке. А чтобы переплюнуть Gerald Schatten с его 716 яйцеклетками, Милитапов начал работу с 15 000 яйцеклеток! Ядро переносили из эпидермальных клеток кожи 9ти летнего резус-макаки Семоса. Первую линию Милитапов получил в январе 2007 года, а спустя несколько месяцев другую. Секрет успешного получения эмбриональных клеток из макаки кроется всего лишь в большом количестве исходного мтериала, работоспособности и наличии хорошего оборудования для визуализации процесса. Ничего принципиально нового Милитапов не сделал. В апреле 2007 он попробовал взять клетки из этих эмбриональных стволовых линий и направить их в эмбриональную программу (то есть имплантировать эмбрионы в самки и получить потомство). Все 77 опытов закончились неудачей. В общем, учитывая низкую эффективность и большое количество требуемого исходного материала, практическое применение находится еще в будущем, хоть сам Милитапов сравнил прорыв с преодолением звукового барьера.

Пока Милитапов успешно бодался с традиционным переносом соматического ядра макак, другие ученые, например японец Yamanaka из Киотского университета и James Thomson из Висконсинского, искали новые пути. И у них получилось (Takahashi, K. et al. Cell 2007 и Yu, J. et al. Science 2007)).

Что сделал Yamanaka. Он давно уже исследовал процессы репрограммирования клеток еще у мышей. На самом деле поиск факторов, которые направляют процессы дифференциации в то, или иное русло, процесс наверное еще более увлекательный, чем само клонирование. На клеточных линиях мышей были уже определены ответственные за это дело белковые молекулы факторы транскрипции. К удивлению Yamanaka, он обнаружил те самые факторы и у человеческих клеток. Затем взял
унипотентную клетку кожи (ту, что уже хорошенечко дифференцировалась и ни на что другое, как для кожи не годится) и загнал в эту клетку четыре фактора (для маньяков пишу названия Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) с помощью ретровирусов. И о чудо! Клетка кожи потеряла свою унипотентность и стала сильно напоминать плюрипотентрую. С этого момента в технологии появился новый термин
”induced” pluripotent stem (iPS). Затем он размножил ее и попробовал обратно во что-то дифференцировать. И ему удалось получить из них нервные клетки и клетки сердечной мышцы, которые на 12й день начинали сокращаться. У этой истории есть немного темных уголков, например фактор c-Myc известный онкоген, так что еще побочный эффект может быть очень неожиданным. Однако James Thomson вроде удалась получить ”induced” pluripotent stem и без этого онкогенного фактора.

Перспективы.

Успешное превращение унипотентной клетки в плюрипотентную закрывает тему об этичности использования эмбрионов за ненадобностью. Главный британский клонировщик, папа овечки Долли Ian Wilmut после публикаций Yamanaka и Thomson резко свернул все исследования по ядерному переносу и перепрограммировал свою лабораторию в Эдинбурге на ”induced” pluripotent stem cells, заявляя, что ощутил облегчение от разрядки этической истерии и видит новую технологию значительно более перспективной. На самом деле еще много неясно в процессах перепрограммирования да и метод с участием ретровирусов и онкогенов весьма небезопасный. Однако считается, что в ближайшие год-два технология отточится до клинически приемлемого уровня.